La méthode de la microscopie brise les barrières en imagerie chimique à l’échelle nanométrique

Les microscopes en super-résolution d’aujourd’hui ont permis d’observer le monde nanométrique avec des détails sans précédent. Cependant, ils nécessitent des étiquettes fluorescentes, qui révèlent des détails structurels mais fournissent peu d’informations chimiques sur les échantillons étudiés.

Cet inconvénient a entraîné le développement de techniques d’imagerie vibratoire, qui peuvent identifier les molécules en fonction de leurs liaisons chimiques uniques sans modifier l’échantillon. Ces méthodes détectent les changements physiques dans les échantillons lorsqu’ils absorbent la lumière infrarouge moyenne (MIR), comme les décalages de l’indice de réfraction causés par l’absorption de chaleur ou les signaux acoustiques induits par la température. Et pourtant, les méthodes existantes luttent souvent avec des niveaux de signal faibles, ce qui rend difficile la réalisation à la fois de haute résolution (comment les détails finement peuvent être vus) et un fort contraste chimique (comment les molécules peuvent être distinguées).

Comme indiqué dans Photonique avancéeune technique nouvellement développée, illumination structurée microscopie photothermique (SIMIP), aborde désormais cette limitation avec deux fois une meilleure résolution que la microscopie conventionnelle.

Développé par des chercheurs de l’Université de Zhejiang, en Chine, dirigé par le professeur Delong Zhang, la nouvelle technique représente une progression significative de l’imagerie vibratoire, ouvrant de nouvelles possibilités pour l’analyse chimique et biologique à l’échelle nanométrique.

Zhang note: “La microscopie SIMIP intègre les principes de la microscopie structurée à l’éclairage à la détection photothermique en milieu médian. La photodétection infrarouge moyenne fournit une spécificité chimique, tandis que la microscopie à éclairage structuré améliore la résolution spatiale de l’échantillon.”

Le système se compose d’un laser en cascade quantique (QCL) qui excite des liaisons moléculaires spécifiques, provoquant un chauffage localisé qui réduit la luminosité des molécules fluorescentes adjacentes. Simultanément, un système SIM composé d’un laser à onde continue de 488 nm et d’un modulateur de lumière spatiale (SLM) génère des motifs de lumière rayés qui sont projetés sur l’échantillon à différents angles.

Ces modèles créent des franges Moiré, codant pour des détails à haute fréquence non résolubles auparavant dans des signaux à basse fréquence détectables qui sont capturés par une caméra CMOS scientifique (SCMOS). En comparant les images prises avec et sans absorption vibrationnelle, SIMIP reconstruit les images haute résolution qui sont riches en informations chimiques et spatiales.

L’équipe a appliqué la SIM Hesse et les algorithmes de déconvolution clairsemés pour atteindre une résolution spatiale plus élevée, jusqu’à ∼60 nm, avec une vitesse d’imagerie de plus de 24 images par seconde, dépassant l’imagerie photothermique mir conventionnelle.

Pour valider la précision de SIMIP, les chercheurs l’ont testée sur des billes de méthacrylate de polyméthyle de 200 nm incorporées avec des colorants fluorescents thermosensibles. En balayant le QCL à travers le 1 420–1 778 cm^-1 La plage, SIMIP a reconstruit avec succès les spectres vibrationnels, correspondant étroitement aux résultats de la spectroscopie infrarouge (FTIR) de Fourier Transform (FTIR).

En termes de résolution, SIMIP a atteint une amélioration de 1,5 fois par rapport à l’imagerie photothermique MIR conventionnelle, avec une largeur complète à demi-maximum (FWHM) de 335 nm contre 444 nm en méthodes standard. De plus, il a pu distinguer les billes de polystyrène et de méthacrylate de polyméthyle dans les agrégats de sous-diffraction, ce qui était impossible avec la microscopie à fluorescence standard.

Un avantage supplémentaire de SIMIP est sa capacité à détecter l’autofluorescence – la fluorescence naturelle émise par certaines molécules biologiques. Cela peut être réalisé en passant de la SIM à large champ à SIM à balayage ponctuel pour une excitation structurée d’autofluorescence ou en utilisant un faisceau de sonde à longueur d’onde plus courte pour une méthode de détection photothermale à large champ pour améliorer la compatibilité avec les configurations optiques existantes.

En intégrant la SIM avec le MIP, SIMIP réalise l’imagerie chimique à grande vitesse et super-résolution au-delà de la limite de diffraction. Cette méthode ouvre de nouvelles possibilités d’observations dans la science des matériaux, la recherche biomédicale et l’analyse chimique. Par exemple, les chercheurs envisagent d’utiliser SIMIP pour détecter les métabolites à petite molécule et analyser leurs interactions avec les structures cellulaires.

L’équipe prévoit désormais d’améliorer la synchronisation temporelle de SIMIP pour améliorer davantage la vitesse d’imagerie et la précision, ainsi que d’explorer les colorants sensibles à la température pour augmenter la sensibilité. Avec des modifications matérielles minimales aux systèmes SIM existants, SIMIP est prêt à l’adoption dans les laboratoires du monde entier.